Molekulárně biologické metody výzkumu a jejich použití

Molekulárně biologické metody výzkumu hrají důležitou roli v moderní medicíně, forenzní vědy a biologie. Díky pokrokům v studiu DNA a RNA, je člověk schopen prozkoumat genomu organismu určit původce, rozpoznat požadované nukleové kyseliny ve směsi kyselin, atd

Molekulárně-biologické metody. Co je to?

Zpátky v 70-80s těchto vědců byl první dešifrovat lidský genom. Tato událost dala impuls k rozvoji genetického inženýrství a molekulární biologie. Studium vlastností DNA a RNA, znamená, že je nyní možné použít tyto nukleové kyseliny za účelem diagnózy onemocnění, studie genu.

Příprava DNA a RNA

Molekulárně biologické diagnostické metody vyžadují výchozí materiál: často se nukleové kyseliny. Existuje několik způsobů, jak vybrat tyto látky z buněk živých organismů. Každý z nich má své výhody a nevýhody, a to je třeba brát v úvahu při výběru metody izolace nukleových kyselin v čisté formě.

1. Příprava DNA Marmur. Způsob spočívá v tom, že se na směs alkoholu látek, vysráží výsledná čistá DNA. Nevýhodou této metody je použití korozivních látek, fenolu a chloroformu.

2. Izolace DNA na výložníku. Hlavní látka, která se zde používá - je guanidin thiokyanát (GuSCN). To podporuje usazování deoxyribonukleové kyseliny na specializovaných podklady, ze kterých může být následně shromážděny pomocí speciálního pufru. Nicméně GuSCN - je inhibitor TCP, a dokonce i malý podíl, který se uloží v DNA může ovlivnit průběh polymerázové řetězové reakce, která je důležitá při práci s nukleovými kyselinami.

3. Srážení nečistot. Způsob se liší od předchozí, se tím, že molekuly samy o sobě nejsou uloženy kyselinu dehoksiribonukleinovoy a nečistoty. Chcete-li to provést, použijte iontoměničů. Nevýhodou je, že ne všechny látky mohou usadit.

4. screeningu. Tato metoda se používá v případech, kdy není nutné mít přesné informace o struktuře molekuly DNA, a že je třeba získat některé statistiky. Důvodem je to, že konstrukce nukleové kyseliny, může dojít k poškození při manipulaci s detergenty, zejména alkálií.

Klasifikace výzkumných metod

Všechny molekulárně-biologické metody výzkumu jsou rozděleny do tří hlavních skupin:

1. Amplifikace (pomocí množství enzymů). To zahrnuje PCR - polymerázová řetězová reakce, která hraje důležitou roli v mnoha diagnostických metod.

2. Neamplifikatsionnye. Tato skupina metod je spojena přímo s prací směsí nukleových kyselin. Příklady jsou 3 druhy blot, in situ hybridizace, atd

3. Metody založené na uznání signálu z molekuly sondy, která se váže na specifickou DNA nebo RNA sondy. Příklad - hybridizační systém hybridní řešení záchytným systémem (HC2).

Enzymy, které mohou být použity v molekulární výzkum metod biologických

Mnoho molekulární diagnostické postupy zahrnují použití široké škály enzymů. Níže jsou nejčastěji používány:

1. restrikční enzym - „cut“ molekuly DNA do potřebných částí.

2. DNA polymerázy - syntetizuje molekulu dvouvláknové deoxyribonukleové kyseliny.

3. Reverzní transkriptáza (reverzní transkriptázy) - použít pro syntézu DNA z templátu RNA.

4. DNA ligáza - je zodpovědný za tvorbu fosfodiesterových vazeb mezi nukleotidy.

5. exonukleázovou - odstraní nukleotidy od koncových částech molekuly deoxyribonukleové kyseliny.

PCR - základní metoda amplifikace DNA

Polymerázová řetězová reakce (PCR) je široce používán v moderní molekulární biologie. Tato metoda, ve které může být jedna molekula DNA, získaná velký počet kopií (amplifikace molekuly).

Hlavní funkce PCR:

- diagnostika onemocnění;

- klonování DNA segmenty, gen.

Pro provedení polymerázová řetězová reakce vyžaduje následující prvky: počáteční molekula DNA, termostabilní DNA polymerázu (Taq nebo Pfu), deoxyribonukleotid fosfáty (zdroje dusíkatých bází), primery (2 primer 1 molekulu DNA), a sama o sobě vyrovnávací systém, který může provádět všechny reakce.

PCR se skládá ze tří kroků: denaturace, nasednutí primerů a prodloužení.

1. denaturace. Při teplotě 94-95 stupňů Celsia proshodit rozbít vodíkové vazby mezi oběma řetězci DNA, a jako výsledek dostaneme dvě jednořetězcové molekuly.

2. napojené primery. Při teplotě 50-60 ° Celsia dochází přístupová primery na koncích molekuly jednořetězcových nukleových kyselin podle typu komplementarity.

3. Prodloužení. Při teplotě 72 stupňů se syntetizuje dcerou dvouřetězcová molekuly deoxyribonukleové kyseliny.

DNA sekvenování

Molekulárně biologické metody výzkumu často vyžaduje znalost sekvence nukleotidů v molekule kyseliny deoxyribonukleové. Pro stanovení genetického kódu sekvenovány. Molekulární diagnostika budoucnosti bude vycházet z poznatků získaných při stanovení lidské sekvence.

Následující typy sekvenování:

• sekvenování podle Maxam-Gilbert;
• Sanger sekvenování;
• pyrosekvenování;
• nanoporovoe sekvenování.